Baseia-se na utilização de ferramentas moleculares como as enzimas de restrição, as ligases do DNA e os vectores.
Enzimas de restrição – reconhecem determinadas sequências de DNA e cortam a molécula nesses locais. As zonas de restrição correspondem a sequências de DNA curtas e simétricas que se lêem da mesma forma nas duas cadeias na direcção 5'-3'.
As extremidades coesivas emparelham através de ligações de hidrogénio entre bases complementares e podem unir-se pela actividade de DNA ligases.
Vector – entidade, constituída por DNA, que transfere o DNA de uma célula ou de um organismo dador para uma célula ou um organismo receptor.
- Os vectores mais utilizados são os plasmídeos e os bacteriófagos.
- Os plasmídeos são pequenas moléculas circulares de DNA que ocorrem naturalmente em algumas bactérias, leveduras e células vegetais.
- Os plasmídeos ligam-se a determinados compostos, tornando-os mais densos, permitindo a sua separação por centrifugação.
Processo:
1 - Selecciona-se uma molécula de DNA dadora, contendo o gene com interesse que se pretende transferir e clonar, e um vector adequado.
2 - A molécula de DNA e o vector são tratados com a mesma enzima de restrição, que corta as duas moléculas em regiões com a mesma sequência de nucleótidos.
3 - Misturam-se os fragmentos de restrição da molécula de DNA e o vector e juntam-se DNA ligases. O vector e os fragmentos de restrição emparelham pelas extremidades coesivas, que são complementares, e a ligase estabelece a ligação.
4 - O vector, contendo o DNA dador, é transferido para uma célula ou organismo receptor.
5 - O DNA dador é incorporado no genoma da célula ou organismo receptor, que passa a possuir um DNA recombinante.
6 - Um meio selectivo ou testes químicos permitem identificar as células que exprimem o gene desejado. No processo descrito formam-se fragmentos de restrição que não têm o gene desejado e nem todas as células receptoras incorporam o DNA dador.
